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RheB Pulldown Activation Assay Kit

价格¥6800.00
品牌NewEast Biosciences    
产地中国 武汉
货号81201
规格30 Assays
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    RheB Pulldown Activation Assay Kit

    Catalog Number:81201

    30 assays

     

    产品说明

     

     

        小GTPases是细胞信号调节因子的一个超级家族。RheB是ras超家族GTPases的成员。RheB已被证明与C-Raf、哺乳动物雷帕霉素靶点(mTOR)、TSC2、毛细管扩张共济失调突变(ATM)、KIAA1303和毛细血管扩张共济失调和Rad3相关相互作用。目前尚无直接测定RheB GTPases活性的方法.

     

    而武汉纽斯特生物技术有限公司推出的Rheb性检测试剂盒主要是依据单克隆抗体能够特异性的识别特殊构象的Rheb-GTP结合蛋白,而不识别Rheb-GDP结合

    蛋白,进而简单并且快速的进行Rheb的活性检测。同时试剂盒中的Rheb-GTP单克隆抗体也可以进行免疫组化实验中细胞和组织中Rheb的活性监测

     

    检测原理

     

      武汉纽斯特生物技术有限公司的Rheb活性检测试剂盒主要是利用识别蛋白特异构象的Rheb-GTP单克隆抗体特异性的去检测细胞提取物或者体外的(样品需要

    进行GTPγS活化处理)活性Rheb-GTP的水平。简言之,特异性识别Rheb活化构象的鼠单克隆抗体可以特异性结合细胞裂解液中的Rheb-GTP活性蛋白,然后利用

    Protein A/G将抗原抗体的结合物吸附下来,再利用识别Rheb蛋白的兔多克隆抗体进行免疫印迹分析进行检测。

     

     

    试剂盒组份及保存

     

    image.png

     

    试剂盒所需自备物品

     

    1. 刺激和未刺激的细胞裂解物;

    2. 蛋白酶抑制剂;

    3. 4 °C 摇杆或者摇床;

    4. 0.5 M EDTA (pH 8.0);

    5. 1 M MgCl2;

    6. 2X reducing SDS-PAGE sample buffer;

    7. 电泳和免疫印迹相关试剂;

    8. 免疫印迹缓冲液 TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween-20);

    9. 免疫印迹封闭缓冲液 (TBST containing 5% 脱脂奶粉 or 3% BSA);

    10 ECL 检测试剂;

     

    实验操作步骤

     

    A  试剂制备

    1X Assay/Lysis Buffer:实验前用去离子水将 5X 的 Assay/Lysis 缓冲液稀释成 1X 的缓冲液,并在使用前加入蛋白酶抑制剂如 1 mM PMSF, 10 µg/mL leupeptin(亮肽素),或 10 µg/mLaprotinin(抑肽酶)。 

     

    B  样品处理

      贴壁细胞

    1. 培养细胞密度达到大约 80%-90%之间(直径 10 cm 培养皿,~107个细胞),并用活性剂或抑制剂进行处理。

    2. 吸去培养基并用冰冷的 PBS 洗涤两次。

    3. 向细胞中加入 1X Assay/Lysis 缓冲液(每个直径 10cm 的组织培养皿中加入 0.5-1mL)。

    4. 将培养皿放置于冰上处理 10-20 分钟。

    5. 用细胞刮棒把细胞从培养皿下分离下来。

    6. 将细胞裂解物转入合适的管中并放置于冰上。

    7. 如果核发生裂解,细胞裂解物可能会变得非常的粘稠并且难以吸取。当这种情况出现时,将细胞裂解物用 27½的注射器针头来回吸取 3-4 次,以破坏基因    组DNA,从而避免上述情况的出现。

    8. 4°C 12000 g, 离心 10 min。

    9. 收集上清(~1-2 mg 总蛋白)并放置于冰上使用。如果样品不立即使用,请将处理后的样品存放于-70°C 条件下。

    悬浮细胞

    1. 培养细胞并用活化剂或抑制剂进行处理。

    2. 计数细胞后离心。

    3. 吸去培养基并用冰冷的 PBS 洗涤两次。

    4. 向细胞中加入 1X Assay/Lysis 缓冲液(每个直径 10cm 的组织培养皿中加入 0.5-1mL)。

    5. 反复吹打细胞进行裂解。

    6. 将细胞裂解物转入合适的管中并放置于冰上。

    7. 如果核发生裂解,细胞裂解物可能会变得非常的粘稠并且难以吸取。当这种情况出现时,

      将细胞裂解物用 27½的注射器针头来回吸取 3-4 次,以破坏基因组DNA,从而避免上述情况的出现。    

    8. 4°C 12000 g, 离心 10 min。

    9. 收集上清(~1-2 mg 总蛋白)并放置于冰上使用。如果样品不立即使用,请将处理后的样品存放于-70°C 条件下。

     

    C.体外用 GTPγS/GDP 处理蛋白以用作阳性和阴性的对照(可选)

     

    注意:在细胞体内环境条件下大约有 10% 的 Rheb 被激活,而在体外用 GTPγS 处理大约有90%的 Rheb 被激活。 

     

    1. 准备两个离心管,每个管中各加入 0.5 mL 的细胞提取物(如果是纯的 Rheb 蛋白则每个管中加入的蛋白量为 1ug)。

    2. 每个管中加入 20ul 0.5M EDTA(终浓度即为 20 mM)。

    3. 一个管中加入 5ul 的 100X GTPγS(终浓度即为 100 uM)作为阳性对照。另一个管中加入 5ul 的 100X GDP(终浓度即为 1 mM)作为阴性对照。

    4. 将离心管置于 30°C 条件下反应 30 min 并不断搅动。

    5. 终止反应:将管置于冰上并加入 32.5ul 1M MgCl2(终浓度即为 60mM)。 

     

    D. 激活 Rheb 的亲和沉淀

    1. 加入 0.5-1 mL(总蛋白的含量大约为 1mg)的细胞裂解物至微量离心管中。

    2. 用1X Assay/Lysis 缓冲液。把每个样品的总体积调整到1ml

    3. 向管中加入 1ul 的活性 Rheb 单克隆抗体。(Cat.# 26910)

    4. 用涡旋振荡仪将 protein A/G 凝胶柱充分混匀,

    5 .然后快速的吸出 20ul 悬浮珠浆液加入离心管中。

    6. 将管置于 4°C 条件下孵育1小时,并轻轻的进行摇动。

    7. 5000g,离心 1 分钟。

    8. 弃上清,这一步要非常小心以避免珠子的损失。

    9. 用 0.5 mL 的 1X Assay/Lysis 缓冲液洗涤珠子三次,离心并弃去上清。

    10. 最后一次洗涤后,小心的移去所有的上清。

    11. 用 20ul 的 2X SDS-PAGE 样品缓冲液重悬样品。

    12. 样品煮沸 5min。 

    13. 5000g,离心 10s。

     

    E. 蛋白印迹实验 

    1. 取 15ul 样品/孔上样 17%配体胶。

    2. 按照制造商的说明进行 SDS-PAGE。

    3. 按照制造商的说明将凝胶蛋白转到 PVDF 或硝化纤维素膜。 

    4. 将 PVDF 膜浸入 100%甲醇 15s,然后在室温放置 5 min 晾干。 注意:如果使用的是硝化纤维 素膜,此步省略。 

    5. 封闭; 用 TBST 缓冲液配制 5%的脱脂牛奶或者 3%BSA 在室温下孵育 1小时进行封闭,并需要恒定振荡。 

    6 用 TBST 缓冲液洗涤膜三次/5min。

    7. 孵育一抗:用 TBST 缓冲液配制的 5%脱脂牛奶或 3%BSA 稀释Anti-Rheb PAb(Cat.# 21098),稀释比例为 1:50-1:1000,主要根据样品中含有的 Rheb 蛋 白的量)室温下孵育 1-2 小时,或者 4°C 条件下过夜孵育.

    8. 用 TBST 缓冲液洗涤膜三次/5min。

    9. 孵育二抗:(例如羊抗兔 IgG-HRP)用 TBST 缓冲液配制的 5%脱脂牛奶或 3%BSA 按1:1000 稀释比例稀释后使用,室温下孵育 1 小时并恒定振荡。

    10. 用 TBST 缓冲液洗涤膜三次/5min。

    11. 使用实验者所选择的检测方法进行显色如 ECL 显色法。

     

     

     示例结果

     

    下图展示的是武汉纽斯特生物技术有限公司的 Rheb 活性试剂盒的典型结果。下面的数据仅供参考

     

    QQ截图20191118145815.png

    Rheb 活性分析

       Rheb 蛋白用 GDP处理 (lane 1) 或 GTPγS (lane 2) 用抗活性的 Rheb进行免疫沉淀(Cat. No. 26910).用 anti Rheb rabbit polyclonal antibody(Cat. No. 21098). 做免疫印迹分析。

     

     

    Related Products
    Catalog# Name Size Price
    26910 Active RheB GTP Monoclonal Antibody  30 μL  ¥4800
    81201 RheB Activation Assay Kit  30 assays  ¥6800
    26015 Anti RheB Mouse Monoclonal Antibody  100 μL  ¥2800
    21098 Anti RheB Rabbit Polyclonal Antibody  100 μL  ¥2600  

     

    Publications:
    1.  Inducible Nitric Oxide Synthase Drives mTOR Pathway Activation and Proliferation of Human Melanoma by Reversible Nitrosylation of TSC2
        Cancer Res. 2014 Feb 15;74(4):1067-78
    2.  SynGAP Regulates Protein Synthesis and Homeostatic Synaptic Plasticity in Developing Cortical Networks
        PLoS One. 2013 Dec 31;8(12):e83941

     

  • 示例结果

     

    下图展示的是武汉纽斯特生物技术有限公司的 Rheb 活性试剂盒的典型结果。下面的数据仅供参考

     

    QQ截图20191118145815.png

    Rheb 活性分析

       Rheb 蛋白用 GDP处理 (lane 1) 或 GTPγS (lane 2) 用抗活性的 Rheb进行免疫沉淀(Cat. No. 26910).用 anti Rheb rabbit polyclonal antibody(Cat. No. 21098). 做免疫印迹分析。

     

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