免疫沉淀实验操作指南

该免疫沉淀实验方法仅供参考，由于每个实验使用的试剂不同，并且涉及不同的物种，组织类型及实验应用，实验人员设计应根据具体情况设计实验步骤和改良。

所需试剂

细胞准备:

• Tris 缓冲盐溶液（TBS）. 使用 10x TBS, pH 7.5 (1.0M Tris HCl, 1.5M NaCl). 用适量去离子水稀释到 可在室温下保存一个月 .

• 裂解缓冲液. 含有0% 合适洗涤剂的TBS、1mg/ml的 牛血清白蛋白 BSA、合适的蛋白质酶抑制剂.

• 稀释缓冲液. 与裂解缓冲液相同, 除去蛋白质酶抑制剂.

• 用于裂解物预处理的琼脂糖轭合物. 预吸收裂解物以移除与一抗二抗的非特异结合. 用来自同一物种的琼脂糖标准 IgG做一抗, 抗宿主的二抗. 用稀释缓冲液1:1制备悬浮液.

一抗:

• 一抗的对照. 对于多抗血清, 使用来自同一物种的未免疫的血清. 单克隆抗体使用相同亚型和纯度.

• 免疫沉淀的琼脂糖轭合物. 使用抗一抗宿主的琼脂糖二抗. 用稀释缓冲液1:1制备悬浮液.

• Tris 缓冲液. 制备05M 的Tris 缓冲液, pH 6.8.

• 2x SDS-PAGE 样品缓冲液

• 2-巯基乙醇

实验步骤

1. 将5 x 107 细胞置于裂解缓冲液中, 在冰上孵育30-60 分钟制备裂解液.

2. 涡旋裂解液后置于离心机上250 x g离心10分钟, 除去细胞核留下上清液.

3. 将上清液于100,000 x g离心30分钟, 或者微型离心机10,000 x g 离心30分钟, 再取上清液.

4. 加入琼脂糖轭合物来预处理裂解液以除去非特异的蛋白结合. 每200 µl 裂解液使用10µl 对照琼脂糖. 于4ºC下震荡1小时. 200 x g离心. 留上清液.

5. 向两个微离心管中各加入 200 µl 含有抗原的预处理了的裂解液. 用稀释缓冲液将体积补至 1 ml.

6. 向一个离心管中加入一抗. 对于多克隆抗血清或腹水加入5-5 µl一抗. 对组织培养上清液加入 10-100 µl一抗. 向第二个离心管加入同等体积的一抗对照. 冰上孵育1小时.

7. 做免疫沉淀时每个管加入50µl琼脂糖轭合物. 4ºC下轻微震荡1小时.

8. 于200 x g离心1分钟或微型离心机离心5秒钟. 用移液管小心移出上清液. 用1 ml 稀释缓冲液轻缓重新悬浮底部团块. 重复洗涤. 先用TBS洗涤最后用5 M Tris, pH 6.8洗涤.

9. 如上所示再次离心. 加入20-50 µl 样品缓冲液. 混合后在100 ºC加热5分钟. 稍微微离心一下, 将上清液直接用于非还原性电泳SDS-PAGE. 如果需用还原性条件, 将上清液转移到新管中加入5% 2-巯基乙醇. 如上混合加热.

10. 电泳蛋白质混合物. 染色凝胶或免疫印迹 (使用我们 Western Blot 的实验方案) 显色. 显现的条带包括抗原的多肽链和使用的抗体.

* 怎样选择正确的珠子: