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Cdc42 Activation Assay Kit

价格6800
品牌NewEastBio   
产地美国
货号80701
免疫原小鼠
规格20Test
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  • 概述

    Configuration-specific Monoclonal Antibody Based 

    Cdc42 Activation Assay Kit 

    Catalog Number:80701 

    20 assay


    产品说明

           小G蛋白是从属于细胞调节因子中的一个超家族。Rho家族是小G蛋白中的一个亚家族,它在细胞运动、细胞分裂以及基因转录中发挥主要作用。而本试剂盒中的Cdc42就属于Rho亚家族中的一种, Cdc42参与生理活动过程中其分子结构会呈现出2种相互转换的形式:与GTP结合的激活状态和与GDP结合的非活性状态。

           目前Cdc42蛋白活性的检测主要是依据小GTP酶Cdc42可以与p21活化激酶(PAK)的p21结合区域(PBD)结合,使PAK活化从而发挥生物学功能,进而间接的进行Cdc42活性功能的监测。然而此方法在检测过程中存在着一定的局限性比如GTP水解成GDP的速度过快以及Cdc42-GTP结合蛋白与p21结合区域之间较低的亲和力,导致这种检测方法的重复性较差。

            纽斯特生物技术有限公司推出的Cdc42活性检测试剂盒主要是依据单克隆抗体能够特异性的识别Cdc42-GTP结合蛋白,而不识别Cdc42-GDP结合蛋白,进而简单并且快速的进行Cdc42的活性检测。同时试剂盒中的Cdc42-GTP单克隆抗体也可以进行免疫组化实验中细胞和组织中Cdc42的活性监测。每套试剂盒可以进行20次检测。


    检测原理

         武汉纽斯特生物技术有限公司的Cdc42活性检测试剂盒主要是利用识别蛋白特异形态的Cdc42-GTP单克隆抗体特异性的去检测细胞提取物或者体外的(样品需要进行GTPγS活化处理)活性Cdc42-GTP的水平。简言之,特异性识别Cdc42活化构象的鼠单克隆抗体可以特异性结合细胞裂解液中的Cdc42-GTP活性蛋白,然后利用protein A/G将抗原抗体的结合物吸附下来,再利用特异性识别Cdc42活化构象的兔多克隆抗体进行免疫印迹分析进行检测。


    试剂盒成分

    1. 特异性识别Cdc42活性构象的鼠单克隆抗体(Anti-active Cdc42, Mouse MonoclonalAntibody (Catalog No. 26905)):小管装--30ul (抗体浓度是1mg/ml),抗体溶于PBS(pH7.4)并包含50%的甘油和0.05%的叠氮化钠。此抗体可以特异性识别所有脊椎动物中的Cdc42-GTP。

    2. Protein A/G agarose (Catalog No. 30301) :小管装—400ul包含200ul Protein A/G agarose     和200ul 20%乙醇溶液。(使用时溶液需要充分混匀,再吸取)

    3. 5X Assay/Lysis Buffer (Catalog No. 30303):小瓶装—30mL包含250 mM Tris-HCl (pH 8.0),     750 mM NaCl, 50 mM MgCl2, 5 mM EDTA, 5% Triton X-100。

    4. 特异性识别Cdc42活性构象的兔多克隆抗体(Anti-Cdc42, Rabbit Polyclonal Antibody  (Catalog No.21010)):小管装--30ul (抗体浓度是1mg/ml),抗体溶于PBS(pH 7.4)并包含有   50%的甘油。

    5. 100 X GTPγS (Catalog No. 30302) :小管装—100ul (10 mM) ,实验中0.5mL细胞裂解液使用      5ul GTPγS标记。

    6. 100 X GDP (Catalog No. 30304) :小管装—100ul (100 mM) ,实验中0.5mL细胞裂解液使用5ul GDP标记。


    储存条件

    试剂盒的成分在试剂盒的有效期限内必须存放于4°C条件下保存。

    试剂(试剂盒内不提供,由实验者自行配置)

    1.  刺激和未刺激的细胞裂解物;

    2.  蛋白酶抑制剂;

    3.  4 °C 摇杆或者摇床;

    4.  0.5 M EDTA (pH 8.0);

    5.  1 M MgCl2;

    6.  2X reducing SDS-PAGE sample buffer;

    7.  电泳和免疫印迹相关试剂;

    8.  免疫印迹缓冲液TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05%

    Tween-20);

    9.  免疫印迹封闭缓冲液 (TBST containing 5% 脱脂奶粉 or 3% BSA);

    10. PVDF或硝酸纤维素膜;

    11.  二抗;

    12.  ECL 检测试剂;


    试剂制备

    1X Assay/Lysis Buffer:实验前用去离子水将5X的Assay/Lysis缓冲液稀释成1X的缓冲液,并在使用前加入蛋白酶抑制剂如1 mM PMSF, 10 µg/mL leupeptin(亮肽素),或 10 µg/mL aprotinin(抑肽酶)。


    样品处理

    贴壁细胞

    1. 培养细胞密度达到大约80%-90%之间(直径10 cm培养皿,~107个细胞),并用活性剂或抑制剂进行处理。

    2. 吸去培养基并用冰冷的PBS洗涤两次。

    3. 向细胞中加入1X Assay/Lysis缓冲液(每个直径10cm的组织培养皿中加入0.5-1mL)。

    4. 将培养皿放置于冰上处理10-20分钟。

    5. 用细胞刮棒把细胞从培养皿下分离下来。

    6. 将细胞裂解物转入合适的管中并放置于冰上。

    7. 如果核发生裂解,细胞裂解物可能会变得非常的粘稠并且难以吸取。当这种情况出现时,将细胞裂解物用27½的注射器针头来回吸取3-4次,以破坏基因组DNA,从而避免上述情况的出现。

    8. 4°C 12000 g, 离心10 min。

    9. 收集上清(~1-2 mg总蛋白)并放置于冰上使用。如果样品不立即使用,请将处理后的样品存放于-70°C条件下。

    悬浮细胞

    1. 培养细胞并用活化剂或抑制剂进行处理。

    2. 计数细胞后离心。

    3. 吸去培养基并用冰冷的PBS洗涤两次。

    4. 向细胞中加入1X Assay/Lysis缓冲液(每个直径10cm的组织培养皿中加入0.5-1mL)。

    5. 反复吹打细胞进行裂解。

    6. 将细胞裂解物转入合适的管中并放置于冰上。

    7. 如果核发生裂解,细胞裂解物可能会变得非常的粘稠并且难以吸取。当这种情况出现时,将细胞裂解物用27½的注射器针头来回吸取3-4次,以破坏基因组DNA,从而避免上述情况的出现。

    8. 4°C 12000 g, 离心10 min。

    9. 收集上清(~1-2 mg总蛋白)并放置于冰上使用。如果样品不立即使用,请将处理后的样品存放于-70°C条件下。


    体外用GTPγS/GDP处理蛋白以用作阳性和阴性的对照

    注意:在细胞体内环境条件下大约有10%的Cdc42被激活,而在体外用GTPγS处理大约有90%的Cdc42被激活。

    1. 准备两个离心管,每个管中各加入0.5 mL的细胞提取物(如果是纯的Cdc42蛋白则每个管中加入的蛋白量为1ug)。

    2. 每个管中加入20ul 0.5M EDTA(终浓度即为20 mM)。

    3. 一个管中加入5ul的100X GTPγS(终浓度即为100 uM)作为阳性对照。另一个管中加入5ul的100X GDP(终浓度即为1 mM)作为阴性对照。

    4. 将离心管置于30°C条件下反应30min并不断搅动。

    5. 终止反应:将管置于冰上并加入32.5ul 1M MgCl2(终浓度即为60mM)。


    检测步骤

    Ι。活性Cdc42 Pull-Down实验

    1. 等分0.5-1 mL的细胞裂解物至微量离心管中。

    2. 向管中加入1mL的1X Assay/Lysis 缓冲液。

    3. 向管中加入1ul的活性Cdc42单克隆抗体。

    4. 用涡旋振荡仪将protein A/G凝胶柱充分混匀,然后快速的吸出20ul悬浮珠浆液加入离心管中。

    5. 将管置于4°C条件下孵育1H,并轻轻的进行摇动。

    6. 5000g,离心1分钟。

    7. 弃上清,这一步要非常小心以避免珠子的损失。

    8. 用0.5 mL的1X Assay/Lysis缓冲液洗涤珠子三次,离心并弃去上清。

    9. 最后一次洗涤后,小心的移去所有的上清。

    10. 用20ul的2X SDS-PAGE样品缓冲液重悬样品。

    11. 样品煮沸5min。

    12. 5000g,离心10s。

    II. 电泳和转膜

    1. 取15ul样品/孔上样17%配体胶。

    2. 按照制造商的说明进行SDS-PAGE。

    3. 按照制造商的说明将凝胶蛋白转到PVDF或硝化纤维素膜。

    III.免疫印迹反应和检测(所有步骤都是在室温下进行,并不断搅拌)

    1. 将PVDF膜浸入100%甲醇15s,然后在室温放置5 min晾干。

    注意:如果使用的是硝化纤维素膜,此步省略。

    2. 封闭:用TBST缓冲液配制5%的脱脂牛奶或者3%BSA在室温下孵育1H进行封闭,并需要恒定振荡。

    3. 孵育一抗:用TBST缓冲液配制的5%脱脂牛奶或3%BSA稀释特异性识别Cdc42活性构象的兔多克隆抗体(稀释比例为1:50-1:1000,主要根据样品中含有的Cdc42蛋白的量),室温下孵育1-2小时,或者4°C条件下过夜孵育。

    4. 用TBST缓冲液洗涤膜三次/5min。

    5. 孵育二抗:(例如羊抗兔IgG-HRP),用TBST缓冲液配制的5%脱脂牛奶或3%BSA按1:1000稀释比例稀释后使用,室温下孵育1小时并恒定振荡。

    6. 用TBST缓冲液洗涤膜三次/5min。

    7. 使用实验者所选择的检测方法进行显色如ECL显色法。

      

    示例结果

    下图展示的是武汉纽斯特生物技术有限公司的Cdc42活性试剂盒的典型结果。下面的数据仅供参考。

     QQ截图20191115102102.png

    Cdc42活性分析。小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)用表皮细胞因子(EGF)处理(Lane 2)和未处理(Lane 1)。细胞裂解物用特异性识别Cdc42活性构象的鼠单克隆抗体(Cat. # 26905)孵育(上图)。活性Cdc42珠子颗粒用特异性识别Cdc42活性构象的兔多克隆抗体(Cat # 21010)进行免疫印迹实验。底部的图展示的是细胞裂解液的活性Cdc42的Western blot实验结果。(底图SDS-PAGE的上样量是上图SDS-PAGE上样量的5%。)


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    Publications:
    1.  Vibrio parahaemolyticus Effector Proteins Suppress Inflammasome Activation by Interfering with Host Autophagy Signaling
        PLoS Pathog. 2013 Jan;9(1):e1003142
    2.  Interferon gamma induces actin polymerization, Rac1 activation and down regulates phagocytosis in human monocytic cells
        Cytokine. 2012 Jan;57(1):158-68
    3.  Invadopodia and rolling-type motility are specific features of highly invasive p190bcr-abl leukemic cells
        European Journal of Cell Biology Volume 91, Issues 11–12, November–December 2012, Pages 978–987
    4.  Epithelial junction formation requires confinement of Cdc42 activity by a novel SH3BP1 complex
        J Cell Biol. 2012 Aug 20;198(4):677-93
    5.  Polarized migration of lymphatic endothelial cells is critically dependent on podoplanin regulation of Cdc42
        Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2011 Jan;300(1):L32-42
    6.  The Aarskog-Scott Syndrome Protein Fgd1 Regulates Podosome Formation and Extracellular Matrix Remodeling in Transforming Growth Factor beta-Stimulated Aortic Endothelial Cells
        Mol Cell Biol. 2011 Nov;31(22):4430-41
    7.  MMP-9 and CXCL8/IL-8 Are Potential Therapeutic Targets in Epidermolysis Bullosa Simplex
        PLoS One. 2013 Jul 19;8(7):e70123
    8.  p21-Activated Kinase (PAK) Regulates Cytoskeletal Reorganization and Directional Migration in Human Neutrophils
        PLoS One. 2013 Sep 3;8(9):e73063
    9.  The Cdc42 Guanine Nucleotide Exchange Factor FGD6 Coordinates Cell Polarity and Endosomal Membrane Recycling in Osteoclasts
        J Biol Chem. 2014 Jun 27;289(26):18347-59
    10.  Cdc42 Inhibitor and Uses Thereof
        United States Patent Application 20140194451
    11.  The α4 Nicotinic Receptor Promotes CD4+ T-Cell Proliferation and a Helper T-Cell Immune Response
        Molecular Pharmacology January 2014 vol. 85 no. 1 50-61


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