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免疫印迹技术
一、目的要求
1、了解蛋白质印迹法的基本原理及其应用。
2、掌握免疫印迹的实验操作方法。
二、原理
免疫印迹法又称为Western blot，是一种利用抗原抗体特异性反应的原理检测固定在固相载体上蛋白质抗原的免疫化学技术方法。待测蛋白既可以是粗提物也可以经过一定的分离和纯化。蛋白质抗原（待测蛋白）根据其分子量大小利用SDS-PAGE电泳方法进行分离；再通过电场作用将凝胶中分离的蛋白转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上；利用针对目的抗原的单克隆或多克隆抗体（一抗）与NC膜上的抗原发生特异性结合，进一步用酶或其他某种物质标记的第二抗体与一抗反应使得目的蛋白条带被酶等所标记。将NC膜上结合的酶与其特异性底物反应使膜上目的蛋白条带显现并被放大。根据蛋白条带的位置确定其分子量大小。该方法广泛应用于蛋白的定性分析和半定量分析。因该实验中电泳分离后的蛋白往往需再利用电转移方法将蛋白转移到固相载体上，所以把这个过程称为免疫印迹。
三、材料
1、Bio-Rad电泳仪；转膜仪；玻璃制胶版；离心机；电炉和暗盒。
2、 丙烯酰胺；N,N’-亚甲双丙烯酰胺；十二烷基硫酸钠SDS溶液(10%)；TEMED；过硫酸胺溶液（10%）。
3、分离胶缓冲液：1.5mmol/L Tris-HCL(pH8.8)；浓缩胶缓冲液：0.5mmol/L Tris-HCL(pH6.8)。
4、2×SDS-PAGE上样缓冲液：0.5mol/L Tris-HCL缓冲液（pH6.8）8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O 32ml混匀。
6、 转膜缓冲液：称取2.9g甘氨酸、5.8gTris、0.37g SDS，加入200ml甲醇，定容至1L。
7、 5%脱脂奶粉；PBS缓冲液和Tween20。
8、第一抗体和辣根过氧化物酶标记的第二抗体。
9显影液、定影液、X胶片和红光源。
四、方法
1、根据目的蛋白的性质，配制适当浓度的SDS-PAGE浓缩胶和分离胶（通常分离胶为12%，浓缩胶为5%）。
2、处理蛋白质样品，按一定的上样顺序加样品30µl于上样孔内，同时加入15µl预染的蛋白Marker，设定100V电压进行电泳，直至蛋白条带完全分离。
3、电泳实验结束后，剥离SDS-PAGE胶，小心放入转膜缓冲液中待用。
4、裁取与胶等面积的硝酸纤维素膜1张，滤纸6张，浸透转膜缓冲液，同时将2张海绵垫也浸泡于转膜缓冲液中。
5、按示意图的顺序和层次进行SDS-PAGE胶、NC膜和滤纸“三民治”转移夹的铺设，夹紧后按正确方向放入转移槽进行蛋白质湿转，同时插入冰盒。
 6、接通电源，设定电压100V，转移2小时。
7、取出转移夹并拆除，用扁头镊子夹出NC膜，观察蛋白Marker的转移效果。
8、将NC膜置于反应盒加入配制好的5%脱脂奶粉，室温封闭1小时。
9、取出NC膜置于第一抗体反应盒（抗体浓度为5-10µg/ml），室温反应2小时。
10、取出NC膜置于20 cm玻璃平皿中，用PBST（含0.5% Tween20）洗涤2次，每次5分钟。
11、将NC膜置于辣根过氧化物酶标记的第二抗体反应盒（抗体浓度为5µg/ml），室温反应1小时。
12、用PBST洗涤2次，每次10分钟。
13、在暗室中历干NC膜，铺于透明塑料袋，加入ECL反应底物。
14、在暗盒中压入X胶片，使蛋白条带暴光适当时间（目的条带蛋白量越高，暴光时间越短）。
15、将X胶片浸于显影液中反应5分钟。
16、用清水冲洗后置于定影液中反应2分钟左右。
17、自来水冲洗后观察、晾干并拍照。
 五、注意事项
1、蛋白上样量要适当，上样前须煮沸3～5分钟。
2、铺NC膜时必须赶尽气泡。
3、抗体用量、反应时间和暴光时间要适当，否则容易出现非特异性条带。
4、过硫酸胺须现配现用，电泳和转膜时正确接入正、负电极。
5、蛋白质转移过程中须保持低温，最好插入冰盒或埋于冰中进行。
六、思考题
1、免疫印迹的特点是什么？
2、实验中转有蛋白的NC膜为什么要用5%脱脂奶粉先封闭再与一抗反应?
3、洗涤液中加入的Tween20有何作用?
4、如何确定压片暴光的时间?显影、定影可以用红光源吗？ |
