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免疫学实验常用试剂及配制方法
缓冲液
1、血细胞保存液
葡萄糖 20.5g
氯化钠 4.2g
枸橼酸钠 8.0g
枸橼酸 5.5g
将上述试剂溶解于1000ml蒸馏水，经4.5kg高压蒸气灭菌15min，4℃保存备用。
2、Hanks 液
原液甲：NaCl 160g
KCl 8g
MgSO4·7H2O 2g
MgCl2·6H2O 2g
CaCl2 2.8g(先溶于100ml双蒸水中)
溶于1000ml双蒸水，加氯仿2ml防腐，4℃保存。
原液乙：
（1）Na2HPO4·12H2O 3.04g
KH2PO4 1.2g
葡萄糖 20.0g
将上述各物溶于双蒸水800ml中。
（2）0.4%酚红溶液：称取酚红0.4g，放入玻璃研钵中，滴加0.1mol/LNaOH,不断研磨，直至完全溶解，约加0.1mol/LNaOH10ml。将溶解的酚红吸入100ml量瓶中，用双蒸水洗下研钵中残留酚红液，并入量瓶中，最后补加双蒸水至100ml。
将（1）液和（2）液混合，补加双蒸水至1000ml，即为原液乙，加氯仿2 ml防腐，置4℃保存。
应用液：
原液甲 1份
原液乙 1份
双蒸水 18份
混合后分装于200ml小瓶中，4.5kg高压蒸气灭菌15min，4℃保存可使用1个月，临用前用无菌的5.6%NaHCO3调pH至7.2～7.6。
3、无Ca2+、Mg2+Hanks液
NaCl 8g
KCl 0.4g
NaHCO3 0.35g
Na2HPO4·12H2O 0.152g
KH2PO4 0.06g
葡萄糖 1g
0.4%酚红 5ml
将上述成分依次溶解或加入到双蒸水中，最后补加双蒸水至1000ml，以5.6%NaHCO3 调整pH至7.4，4℃冰箱保存备用。
4、0.2mol/L磷酸盐缓冲液（PB）
A液（0.2mol/L NaH2PO4）：称取NaH2PO4·H2O 27.6g（或NaH2PO4·2H2O31.2g），溶于蒸馏水中，最后补加蒸馏水至1000ml。
B液（0.2mol/L Na2HPO4）：称取Na2HPO4·7H2O53.6g（或Na2HPO4·12H2O 71.6g，或Na2HPO4·2H2O35.6g），加蒸馏水溶解，最后加水至1000ml。
0.2mol/L缓冲液配制：A液Xml中加入B液Yml，为0.2mol/L PB（见下表）。若再加蒸馏水至200ml则成为0.1mol/L PB。
0.2mol/L磷酸盐缓冲液（PB）的配制
5. 磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）
（1）0.01mol/L PBS（pH7.0）
0.2mol/L A液 16.5ml
0.2mol/L B液 33.5ml
加NaCl 8.5g
用蒸馏水稀释至1000ml。
（2）0.02mol/L PBS（pH7.2）
0.2mol/L A液 28ml
0.2mol/L B液 72ml
加NaCl 8.5g
用蒸馏水稀释至1000ml。
加NaCl 8.5g
用蒸馏水稀释至1000ml。
(注：A、B两液配制见“4”)。
6. Tris缓冲液（TBS和THB）
（1）0.05mol/L TBS（pH7.4）的配制
Tris（三羟甲基胺基甲烷） 12.1g
NaCl 17.5g
加蒸馏水 1500ml
磁性搅拌下滴加浓HCl至pH为7.4，再加蒸馏水至2000ml即可。如需含1%TritonX﹣100，则在滴加HCl前先加200ml TritonX﹣100.
(2)THB的配制
A液（0.2mol/L Tris）：称取2.423g Tris（MW121.14）溶于100ml蒸馏水中。
B液（0.1mol/L HCl）:取37%HCl（比重1.19）0.84ml，加入蒸馏水中，使成100ml。
不同pH（7.19～9.10）的0.05mol/L THB配制：取A液25 ml加入B液X ml（见下表），补加蒸馏水至100ml。
7. 碳酸盐-碳酸氢钠缓冲液（0.1mol/L）
（注意：该缓冲液在Ca2+、Mg2+存在时不得使用）
8. 0.1mol/L 醋酸缓冲液（pH3.6～5.6）
A液：0.2mol/L 醋酸：冰醋酸﹝99%～100%，相对密度（比重）1.050～1.054﹞11.5ml，加蒸馏水使成1000ml。
B液：0.2mol/L 醋酸钠水溶液：醋酸钠（C2H3O2Na）16.4g或(C2H3O2Na·3H2O)27.2g，加蒸馏水使成1000ml。
缓冲液：按下表将A液X ml+B液Y ml+蒸馏水至1000ml，即配成所需的pH。
9. 0.05mol/L pH 8.6 巴比妥缓冲液
巴比妥 1.84g（加蒸馏水200 ml加热溶解）
巴比妥钠 10.3g
叠氮钠 0.2g
加蒸馏水溶解，并补加到1000 ml。
10.硼酸盐缓冲液（Borate saline buffer）
a. 不同pH硼酸盐缓冲液
0.2mol/L 硼酸（H3BO3）：硼酸12.37 g加水至1000 ml。
0.05 mol/L 硼砂（Na2B4O7）：硼砂19.07 g加水至1000 ml。如下配制。
11. 磷酸缓冲甘油封固剂（pH8.0）
pH 8.0 0.1 mol/L PB：取0.2 mol/L Na2HPO4 94.7 ml加0.2 mol/L NaH2PO45.3 ml，蒸馏水加至200 ml。
9份甘油与1份 pH8.0 0.1 mol/L PB混合，即可。用于免疫荧光实验。
12. pH 8.2 0.1mol/L 甘氨酸缓冲液
取甘氨酸7.5 g ，NaCl 8.5 g，加蒸馏水至1000 ml，再加1 mol/L NaOH 2～3 ml，调至pH 8.2。
二、培 养 液
1. RPMI-1640 基础培养液
（1）RPMI-1640 10.4g
（2）HEPES 2.4gg
(3) 谷氨酰胺 0.15g
(4) 碳酸氢钠 2g
(5) 葡萄糖 3.6
(6)丙酮酸钠 0.11g
用适量蒸馏水并定容至2000ml，用0.22µm微孔滤膜滤过除菌。分装后4℃保存。
2. 200 mmol/L L-谷氨酰胺溶液
L-谷氨酰胺 2.922g
三蒸水 100 ml
溶解后，过滤除菌，分装小瓶，每瓶10 ml，—20℃保存。
3.两性霉素B配法（25g/ml）
两性霉素B 2.5 mg
三蒸水 100 ml
过滤除菌，分装小瓶，每瓶1 ml，—20℃保存。
4. 无血清RPMI-1640的配法
RPMI-1640培养液 100 ml
L-谷氨酰胺（200 mmol/L） 1 ml
抗生素（青链霉素）（1万∪/ml） 1 ml
7.5%NaHCO3 2.8 ml
混匀后即可使用。
5. RPMI-1640 完全培养液
RPMI-1640 培养液 100 ml
L-谷氨酰胺（200 mmol/L） 1 ml
抗生素（青链霉素）（1万∪/ml） 1 ml
两性霉素B（25g/ml） 1 ml
7.5%NaHCO3 2.8 ml
灭活小牛血清 15 ml
混匀后即可使用。
6. TC199培养液
取199培养基干粉9.9g，溶于三蒸水1000 ml，加温使溶，加NaHCO3 1.0g，使pH调至7.2，滤膜除菌，分装，4℃保存。
7. Eagle MEM培养液
（1）将MEM（标准包装）干粉倒入500 ml三蒸水（温度为18～20℃）搅匀，待溶解。并用另外500 ml三蒸水冲洗MEM包装内的剩余粉末，汇集到一块，搅拌直至完全溶解透明。
（2）每升MEM加入2.2 g NaHCO3（或7.5% NaHCO3 溶液29.3 ml），同时，也可加入其他补充物如抗生素、HEPES等。
（3）用1mol/L NaOH和1 mol/L HCl调pH，pH可比需要值高出0.1。
（4）滤膜除菌，分装，置4℃保存。4℃保存。
三、ELISA试剂
1. 包被缓冲液（pH 9.6、0.05mol/L 碳酸盐缓冲液）
Na2CO3 1.59g
NaHCO3 2.93g
加入蒸馏水 至1000 ml
2. 洗涤缓冲液（pH 7.4、0.02 mol/L Tris-HCl-Tween 20）
Tris（三羟甲基氨基甲烷） 2.42 g
1 mol/L HCl 13.0 ml
Tween 20 0.5 ml
加蒸馏水至 1000 ml
3. 稀释液
牛血清白蛋白（BSA） 0.1 g
加洗涤缓冲液至 100 ml
或使用以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成的5%～10%液。
4. 终止液（2 mol/L H2SO4）
蒸馏水178.3 ml，逐滴加入浓硫酸（98%）21.7 ml。
5. 底物缓冲液（pH 5.0磷酸-柠檬酸缓冲液）
0.2 mol/L Na2HPO4（28.4 g/L） 25.7 ml
0.1 mol/L 柠檬酸（19.2 g/L） 24.3 ml
加蒸馏水50 ml
6. TMB（四甲基联苯胺）使用液
TMB（10 mg/5 ml 无水乙醇） 0.5 ml
底物缓冲液（pH 5.5） 10 ml
0.75% H2O2 32 µl
四、其他试剂溶液
1. 1%酚红
取1 g酚红置于乳钵中，加入少量1 mol/L NaOH 研磨，将溶解液移至100 ml量瓶中。分批加入1 mol/L NaOH研磨，直至酚红溶解，所得染液都移入量瓶中，NaOH的用量不能超过7 ml。加双蒸水至100 ml，过滤，置室温或4℃保存。
2. 碳酸氢钠液
调pH常用浓度有7.5%、5.6%、3.7%三种。用双蒸水（或去离子水）配制。无菌过滤除菌，小量分装；或110℃灭菌10 min，分装，置4℃保存。
3. 肝素抗凝剂
取肝素用Hank's液（或其他溶剂）稀释至终浓度为250∪/ml，112℃灭菌15 min（或115℃ 10 min）后分装，—20℃保存。用时按每毫升血液加0.1～0.2 ml肝素抗凝。或按实验要求浓度配制、使用。
4. 姬姆萨（Giemsa）染液
姬姆萨染料 0.8 g
甘油 50 ml
甲醇 50 ml
将0.8 g染料加到50 ml甘油中，混匀，置60℃水浴箱内2 h，不时搅拌。取出晾至于室温相同时加入甲醇50 ml，用磁力搅拌过夜。用滤纸过滤，滤液即为原液。应用时用PBS（1/15 mol/L，pH 6.4～6.8）或蒸馏水稀释10倍
5. 瑞氏（Wright）染液
瑞士染料 1.8 g
纯甲醇 600 ml
将 1.8 g染料置于乳钵中，加入少量纯甲醇研磨，将溶解的染料移至洁净的棕色玻璃瓶中。分批加入甲醇研磨，直至染料全部溶解。配制的染料置室温1周后即可使用。新鲜配制的染料偏碱，放置后可显酸性。染料储存越久，染色越好。要封闭保存，以免吸收水分影响染色效果。也可加入30 ml中性甘油，染色效果更好。
6. 瑞氏-姬姆萨染液
取瑞士染液5 ml，姬姆萨原液1 ml，加蒸馏水或PBS（pH6.40～6.98）6 ml。如沉淀生成须重新配制，或按以下方法配制：
瑞士染料 0.3 g
姬姆萨染料 0.03 g
甲醇 100 ml
配制方法同瑞士染液。
7. 0.5%台盼蓝（trypan blue）
台盼蓝 1.0 g
双蒸水 100 ml
将台盼蓝加入双蒸水中充分溶解（配制方法同瑞士染液），过滤去沉淀，置4℃或室温保存。临用时用18 g/L NaCl盐水1﹕1稀释后即可应用。
8. 0.2%伊红 Y（eosin Y）
伊红 Y 0.4 g
双蒸水 100 ml
配制方法同0.5%台盼蓝。
9. 0.1%中性红（neutral red）
中性红 1 g
双蒸水 100 ml
配制方法同0.5%台盼蓝。临用前用Hank's液稀释10倍即可用于染色。
10. Nessler 试剂（奈氏试剂）
a.氯化汞 6.0 g、KI 12.4 g、20% NaOH 30 ml加蒸馏水至100 ml。
b.碘化汞11.5 g、碘化钾8 g，加蒸馏水50 ml，完全溶解后过滤，加20%KOH 50 ml。
11. Alsever液（阿氏液）
葡萄糖2.05 g、柠檬酸钠（2H2O）0.80 g、NaCl 0.42 g、蒸馏水100 ml，溶解后，以10%柠檬酸调pH6.1，过滤、分装，0.055MPa（8磅/吋2）20 min灭菌，4℃保存。
12. 0.4%酚红溶液
称0.4 g酚红置于玻璃研钵中，逐渐加入0.1mol/L NaOH，不断研磨直至所有颗粒几乎完全溶解，所加NaOH量应为11.7 ml，将已溶解的溶液吸入100 ml量瓶中，用双蒸水洗研钵数次，均收集于量瓶中，最后加双蒸水至100 ml，摇匀，保存于4℃冰箱备用。
13. 氨基黑染色液
将1.0 g氨基黑10B 溶在1 mol/L 醋酸50 ml中，再加0.1 mol/L 醋酸钠500 ml，混匀后置棕色瓶中保存。
14. 脱色液
冰醋酸3 ml、甘油10 ml、冰蒸馏水87 ml混匀。
15. 清洁液
重铬酸钾100 g，蒸馏水1000 ml，浓硫酸1000 ml。加重铬酸钾加入蒸馏水中，使之自然溶解或水浴溶解，亦可在大坩埚中加热溶解，然后慢慢加入浓硫酸，边加边搅拌，见发热过剧则稍停，冷却后再继续加。
盛清洁液的容器要坚固，上加厚玻璃盖，操作时要穿橡皮围裙、长统胶靴、戴上眼镜和厚橡皮手套，以保安全。
洗液一旦变绿，表示铬酸已经还原，失去了氧化能力，不宜再用，如将这样洗液加热，再加适量重铬酸钾，又可重新使用。
16. 麻醉剂（1%戊巴比妥）
戊巴比妥 10g
生理盐水或 PBS 加至 1000 ml
溶解过滤后分装，4℃保存。
应用于兔及小鼠等动物麻醉。剂量为20mg/kg体重。 |
