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双向免疫扩散技术
目的要求
1、熟悉双向免疫扩散试验的基本原理，练习实验操作方法。
2、观察抗原、抗体扩散后在琼脂凝胶中形成的沉淀线。
3、了解双向免疫扩散实验的用途。
二、原理
可溶性抗原与相应抗体发生特异性结合，在一定的温度和电解质存在的条件下，比例适当的抗原和抗体经过一定的反应时间，能够形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。沉淀反应的抗原可以是多糖、蛋白质、类脂等。抗原、抗体在凝胶中自然扩散，于接触界面发生免疫反应，出现抗原抗体复合物沉淀，叫做免疫扩散反应。双向免疫扩散是指可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散,彼此相遇后形成一定类型的特异性沉淀线。沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原抗体的特异性及相互间比例，而且与其分子大小及扩散速度相关。当抗原、抗体存在多个系统时，可呈现多条沉淀线乃至交叉反应。依据沉淀线的形态、条数及位置可了解抗原或抗体的若干性质，如浓度、特异性等。
沉淀线形成的位置与抗原、抗体浓度有关，抗原浓度越高，形成的沉淀线距离抗原孔越远；抗体浓度越高，形成的沉淀线距离抗体孔越远。因此，当固定抗体的浓度，稀释抗原，可根据已知浓度的抗原沉淀线的位置，测定未知抗原的浓度；同理，若固定抗原的浓度，亦可测定抗体的效价。
观察两个邻近的抗原孔与一个抗体孔所形成的沉淀线的形状，可以判断这两种抗原是否有共同成分。(1) 融合性沉淀孤，说明两孔中抗原相同，为同一性反应；(2) 两沉淀线独自形成并形成交叉，说明两孔中的抗原完全不同，为非同一性反应；(3) 融合性沉淀弧出现支线，或同时有另一条或两条沉淀线，说明两孔中抗原有相同成分又有不同成分，此为部分同一性反应
三、材料
1、1％生理盐水琼脂。
2、羊抗鼠IgG。
3、鼠IgG。
4、兔IgG。
5、羊IgG。
6、人IgG。
7、方阵型打孔器或单孔金属管（孔径约3mm）。
8、37℃培养箱。
9、吸管、微量加样器、载玻片、注射针头、滤纸、纱布及带盖铝盒。
四、方法
1、在沸水中加热溶解1％琼脂。
2、将载玻片置于水平桌面上，取已溶化的盐水琼脂4ml，倾注于载玻片上，使其自然流成平面。
3、琼脂凝固后，取方阵型打孔器打孔，或单孔金属管打孔，再用注射针头挑去孔中琼脂。孔径3mm，孔距距15mm 。每块琼脂板打两个方阵型。
4、用油性记号笔在琼脂板的底面将孔编号。
5、用微量加样器加羊抗鼠IgG，鼠IgG于两个方阵型的中央孔中，第一方阵型的周围孔依次加入鼠IgG、兔IgG、羊IgG、人IgG。第二方阵型周围各孔依次加入1：1、1：2、1：4、1：8稀释的羊抗鼠IgG。
6、将玻片置于有湿纱布的有盖铝盒内。
7、37℃培养箱静置，24小时后取出载玻片，观察抗原抗体复合物形成的白色沉淀线。
五、注意事项
1、加样时不要将琼脂划破，样品不要溢出加样孔，以免影响沉淀线的形成。
2、反应时间要适当。时间过长，会出现沉淀线解离、无沉淀线或沉淀线模糊不清。
3、加样时作好标记，不同浓度抗体和抗原不要混淆，否则影响试验结果。
4、加样时，吸取每份标本均应更换塑料吸头。
六、思考题
1、根据观察的结果分析各种抗原有无共同成份，是否存在交叉反应？
2、羊抗鼠IgG抗体的效价如何？哪种稀释度比较理想？
3、该技术可应用于哪些方面的研究？ |
