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B淋巴细胞杂交瘤的建株
一、 目的要求
1、掌握分泌特异抗体杂交瘤细胞建株的原理。
2、熟悉细胞融合的操作过程及技术要点。
3、了解细胞杂交后细胞生长状态的观察、分析与处理方法。
二、原理
根据抗体选择学说，一个B淋巴细胞只能产生一种针对它能够识别的特异性抗原决定簇的抗体。从一个祖先B细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系称为克隆（clone，又称无性繁殖细胞系或克隆系）。来自克隆系的细胞基因是完全相同的，产生的抗体也完全相同。这种从一株克隆系产生的性质相同的均一抗体称为单克隆抗体（monoclonal antibody, 单抗）。它们具有完全相同的分子结构和生物学特性，但这种具有分泌功能的B淋巴细胞难以在体外长期存活。利用细胞融合技术，将上述B淋巴细胞与在体外能长期增殖的骨髓瘤细胞进行融合，经过选择培养获取杂交细胞，这种细胞称为杂交瘤细胞（Hybridoma）。该细胞既有免疫B淋巴细胞分泌特异性单抗的功能，又具有骨髓瘤细胞无限增殖的能力。故应用杂交瘤细胞生产单克隆抗体。
HAT代表次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基碟呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶（thymidine, T）三种物质。肿瘤细胞的DNA生物合成有两条途径，一是生物合成的主要途径，即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，进而合成DNA。在核酸合成过程中，叶酸衍生物为合成核苷酸所必需，氨基碟呤是一种叶酸拮抗物，它可阻断细胞内DNA生物合成的主要途径。此时若培养液中含有核苷酸合成的中间产物次黄嘌呤和胸腺嘧啶，则细胞的DNA合成可通过另一条替代途径进行，即在HGPRT和 TK（thymidine kinase,TK）的催化下，利用外源性的次黄嘌呤和胸腺嘧啶合成核苷酸。若缺乏其中一种酶，该合成途径被阻断。免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后。存在5种不同的细胞类型：脾细胞和骨髓瘤细胞的异核融合体；脾细胞和骨髓瘤细胞的同核融合体及未发生融合的脾细胞和骨髓瘤细胞。脾细胞及其同核融合体在培养液中不能长期生长，7天左右即死亡；骨髓瘤细胞及其同核融合体在HAT 培养液中，其 DNA合成的主要途径被A阻断后，由于缺乏HGPRT而不能利用培养液中的H，虽TK可利用T，但不能完成完整的DNA合成过程。只有脾细胞和骨髓瘤细胞的异核融合体即杂交瘤细胞，既从脾细胞获得了HGPRT和 TK，从而利用培养液中的H和T合成DNA，又从骨髓瘤细胞获得了无限增殖的能力，因此能在HAT选择培养液中生存下来。
三、材料
1、特异抗原免疫的BALB/c小鼠。
2、小鼠骨髓瘤细胞sp2/0或X63。
3、细胞融合剂PEG（分子量1500～4000）。
4、离心机。
5、水浴锅。
6、80～100目钢丝筛。
7、简易解剖架。
8、玻璃注射针芯。
9、8～10cm平面皿。
10、PBS、基础培养基及HAT培养基。
11、96孔细胞培养板。
12、吸管、吸球、50ml塑料离心管、烧杯、75%酒精消毒、小剪刀及镊子等。
四、方法
1、取免疫BALB/c小鼠,摘除眼球致死，自来水冲洗干净，75%酒精消毒5分钟。
2、将小鼠腹部朝上，放置在简易的解剖架上。
3、打开腹部，取出脾脏，置于钢丝筛内，将筛放在盛有约15ml的PBS或基础培养基的平面皿中，用玻璃注射针芯轻轻压磨脾脏成单个细胞。移去钢丝筛，计数细胞，用吸管将细胞转移至离心管中。
4、取小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0或X63混合（5:1）于50ml塑料离心管中，1500rpm离心5分钟，弃上清（要彻底），轻轻弹松细胞。
5、用移液管取0.5ml PEG溶液（放置37℃水浴预热），将移液管的尖端插入管底，轻轻地搅动细胞并缓慢地滴加PEG，1min内加完。静置1min。再漫漫加入基础培养液20～25ml。1000rpm×5min离心，弃上清。
6、将沉淀细胞轻悬于适量的HAT选择培养液中，滴加在96孔培养板中，每孔0.1ml（2滴），静置3min, 显微镜下观察融合细胞的状态。
五、注意事项
1、取小鼠脾脏细胞时，要正确抓住小鼠，以免被其咬伤。
2、脾脏细胞和骨髓瘤细胞混合离心后，要彻底弃去上清。
3、融合时要缓慢加入PEG融合，并边加边轻轻搅拌，以保证细胞与融合剂的充分接触。
七、思考题
1、细胞融合后有几种状态的细胞存在？
2、HAT培养基选择培养的原理与目的是什么？ |
