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小鼠腹腔细胞及巨噬细胞的制备
一、 目的要求
1、掌握小鼠腹腔细胞及巨噬细胞的获取方法。
2、了解小鼠腹腔细胞及巨噬细胞的作用及用途。
二、原理
单核-巨噬细胞作为免疫系统重要的组成成分参与机体固有免疫应答，作为桥梁连接机体固有免疫应答和适应性免疫应答。单核-巨噬细胞的分离和检测对体内外评估机体的免疫功能和应用单核细胞进行免疫干预具有重要意义。从小鼠腹腔可获得大量的以巨噬细胞为主的腹腔细胞，是免疫学研究中常用的单核-巨噬细胞来源。利用37ºC预温RPMI 1640培养液冲洗腹腔，可诱导腹腔巨噬细胞游出进入洗液；由于单核巨噬细胞具有强烈粘附塑料器皿的特性，可将抽出腹腔的巨噬细胞置入冰上预冷的容器并用预冷PBS缓冲液洗涤防止细胞在操作过程中损耗，在获得腹腔细胞后，可利用贴壁法去除非贴壁细胞而富集巨噬细胞。如需要更多量的巨噬细胞，可通过预先向小鼠腹腔注射刺激剂降植烷（Pristane ）或无菌液体石蜡油等诱导腹腔炎症，从而促使巨噬细胞大量渗出。
三、材料
1、6～8周龄小鼠。
2、RPMI 1640培养液。
3、胎牛血清。
4、PBS（无Ca2+ Mg2+ ）。
5、小鼠腹腔注射刺激剂降植烷（Pristane ）或无菌液体石蜡油。
6、0.4%台盼兰染液。
7、温控低速离心机。
8、显微镜。
9、细胞计数板、离心管、6孔塑料培养板、50 ml塑料针筒、剪刀与镊子等。
四、方法
1、取6～8周龄小鼠，用75% 酒精消毒皮肤，腹腔注射Pristane（或液体石蜡油） 0.5ml，3～4d后收集腹腔细胞。如要收集腹腔静止巨噬细胞，则不注射刺激剂。
1、 断颈处死小鼠，浸入75% 酒精，消毒3～5 min。
2、 固定小鼠，用眼科剪于小鼠腹部中央剪一横向切口，用两手向头尾两侧撕开暴露腹壁肌肉。
3、 用50 ml注射器吸取20 ml 37ºC预温的RPMI 1640培养液，一手持镊子轻轻提起腹壁，一手持注射器将针尖刺入腹腔。
4、 向腹腔推入10 ml RPMI 1640培养液，轻弹小鼠腹部，将针尖进至肝肾隐窝最低点，回吸洗液，如此迅速反复冲洗腹腔5次后，尽量将洗液抽出。
5、 迅速转移至预先至于冰上的50 ml离心管内，1000 rpm 4ºC 离心5 min，弃上清。
6、 用PBS 洗涤细胞3次，每次1000 rpm 4ºC 离心5 min。
7、 弃上清，用预冷的含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液重悬细胞至2×105/ml。
8、 贴壁法富集巨噬细胞：
（1） 按4×105/cm2将腹腔细胞细胞接种于6孔塑料培养板，37ºC 5%CO2 培养2h。
（2） 轻晃培养板，吸取培养上清，用37ºC预温的RPMI 1640培养液轻轻洗涤培养孔3次。
（3） 用冰上预冷的PBS（无Ca2+ Mg2+ ）冲洗培养孔，将贴壁细胞冲洗下来，迅速置入冰上预冷的离心管中，1000 rpm 4ºC 离心5 min，弃上清。
（4） 用预冷的含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液重悬细胞至所需浓度备用。并用台盼兰拒染法计算细胞活力。
五、注意事项
1、在腹腔细胞冲洗和洗涤以及重悬的操作过程中，注意实验器材和溶液的预冷，防止巨噬细胞贴附于实验器皿而导致细胞损耗。
2、操作过程中严格注意无菌操作。
六、思考题
1、怎样确定腹腔巨噬细胞纯度？
2、在免疫学研究中，腹腔来源巨噬细胞有何用处？
3、除上述方法外，还有哪些获得单核-巨噬细胞的途径？ |
